Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4240
Grüter, Bärbel
Bindungsstudien an einem bakteriellen zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanal
IX, 124 S., 2007
Ionenkanäle kontrollieren den Ionenfluss über Zellmembranen. Sie sind für viele biologische
Prozesse von entscheidender Bedeutung. Zyklisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle
(CNG-Kanäle) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle, deren Öffnungsverhalten durch cAMP
bzw. cGMP reguliert wird. Während die physiologische Funktion dieser Kanäle weitgehend
untersucht ist, ist nur wenig über ihren molekularen Öffnungsmechanismus bekannt.
Homologe, bakterielle Kanäle bieten eine neue Grundlage zur Erforschung dieses
Schaltmechanismus, da sie in großen Mengen in Bakterien exprimiert werden können. Sie
eignen sich daher besonders gut für biochemische Untersuchungen.
In dieser Arbeit wurden biochemische und biophysikalische Untersuchungen an einem
zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanal (MlCNG) aus dem Bakterium Mesorhizobium loti
(M. loti) durchgeführt. Die Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD) dieses Kanals wurde
in Escherichia coli (E. coli) exprimiert und für quantitative Bindungsmessungen in einer
cAMP-freien Form gereinigt. Ich konnte die Bindungsaffinitäten für cAMP, cGMP sowie für
einige 8-substituierte Analoga mit der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) und
alternativ, mit einem Fluoreszenzassay bestimmen. Die Bindungsaffinitäten für cAMP und
cGMP liegen im submikromolaren Bereich, wobei cAMP mit einer ca. fünffach höheren
Affinität an die CNBD bindet als cGMP.
Das MlCNG-Protein wurde ebenfalls in E. coli exprimiert und affinitätschromatographisch
gereinigt. Das oligomere Laufverhalten des MlCNG-Proteins wurde mit dem des
KcsA-Kanals aus Streptomyces lividans verglichen. Die Bindungsaffinität für cAMP wurde
mit der ITC, die Affinitäten für weitere zyklische Nukleotide wurden mit dem
Fluoreszenzassay bestimmt. Der KD-Wert für cAMP ist für den gesamten Ionenkanal etwa
viermal höher als für die isolierte Bindestelle.
Ion channels control the flow of ions across cellular membranes. They play a crucial role in
many biological processes. CNG (cyclic nucleotide-gated) channels belong to the family of
ligand-gated ion channels which are regulated by cAMP and cGMP. While the physiological
function of these channels is well examined, only little is known about their molecular
mechanism of opening (“gating”). Homologous bacterial ion channels offer a novel basis to
explore the “gating”-mechanism, because they can be expressed in high quantities in bacteria
and, therefore, are applicable for biochemical studies.
In this work, biochemical and biophysical studies were performed on the cyclic
nucleotide-gated ion channel (MlCNG) from the bacterium Mesorhizobium loti and its
isolated cyclic nucleotide-binding domain (CNBD). The CNBD protein was expressed in
Escherichia coli (E. coli) and purified in a cAMP-free form. I determined the binding
affinities for cAMP, cGMP and some 8-substituted analogs via isothermal titration
calorimetry (ITC) and, alternatively with a fluorescence assay. The binding affinities for
cAMP and cGMP are in the submicromolar range. cAMP binds to the CNBD with a five fold
higher affinity than cGMP.
The MlCNG protein was expressed in E. coli as well and purified via affinity
chromatography. The oligomeric running behaviour of the MlCNG protein was compared
with that of the KcsA channel from Streptomyces lividans. The binding affinity for cAMP was
determined via ITC, the affinities for some other cyclic nucleotides were obtained from the
fluorescence assay. The KD value for cAMP is about four times higher for the full-length
channel than for the isolated binding domain.
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