Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4193
Brühl, Anja
Bestrophine: potentielle Kandidaten für olfaktorische Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle
148 S., 2005
Die olfaktorische Signalwandlung findet in den Zilien olfaktorischer Neurone statt. An der
Erzeugung des Aktionspotentials sind Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle maßgeblich beteiligt. Sie
leiten einen depolarisierenden Cl--Strom. Die Klonierung olfaktorischer Ca2+-aktivierter Cl--
Kanäle ist bisher noch nicht gelungen. Um die Kanäle molekular und biochemisch zu
charakterisieren, wurde in dieser Arbeit die ODORA-Zelllinie benutzt, die olfaktorischen
Ursprungs ist und die gesuchten Kanäle exprimiert. Bestrophin-Proteine gelten zurzeit als die
besten Kandidaten für Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle. Ich habe deshalb Mitglieder der
Bestrophin-Genfamilie aus ODORA-Zellen kloniert.
Es ist mir gelungen insgesamt vier Bestrophin-Gene der Ratte vollständig zu klonieren. Die
Bestrophin-cDNAs wurden transient in HEK 293-Zellen transfiziert und die heterologe
Expression der Proteine durch α-HA-Antikörper nachgewiesen. Zusätzlich wurden stabile
Zelllinien hergestellt, die die Bestrophin-Proteine konstitutiv exprimieren.
Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass Bestrophin 1 homooligomere, Ca2+-
aktivierte Cl--Kanäle bildet. Gegen alle vier Bestrophine wurden Isoform-spezifische
Antikörper hergestellt. In Western Blots wurden Bestrophin-Proteine in
Membranpräparationen der stabilen Zelllinien sowohl von den spezifischen α-Bestrophin-
Antikörpern als auch von -HA-Antikörpern erkannt.
Da der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal in ODORA-Zellen vermutlich durch CaM reguliert wird,
wurde nach potentiellen CaM-Bindestellen in den Bestrophinen gesucht. Alle vier
Bestrophin-Proteine binden an CaM-Agarose und können mit Ca2+-freiem Puffer eluiert
werden. Ein Aminosäureaustausch in der 1-5-8-14 CaM-Bindestelle von Bestrophin 2 und 3
wirkt sich allerdings nicht auf die CaM-Bindung aus. Immunhistochemisch wurde
Bestrophin 2 in olfaktorischen Neuronen nachgewiesen. Bestrophin 2 befindet sich
hauptsächlich in den Dendriten und Somata. In einigen Präparaten waren auch Zilien gefärbt.
Da Bestrophin 2 nicht eindeutig mit dem zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanal
(CNGA2-Untereinheit) kolokalisiert ist, kann die Frage, ob Bestrophine den olfaktorischen
Ca2+-aktivierten Cl--Kanal bilden, noch nicht abschließend beantwortet werden.
Olfactory signal transduction takes place in the cilia of olfactory neurons. Ca2+-activated Cl--
channels participate in the generation of action potentials in these cells. The channels conduct
a depolarizing chloride current. Cloning of olfactory Ca2+-activated Cl--channels has not been
successful, yet. To identify these channels molecularly we used the ODORA cell-line which
is of olfactory origin. ODORA cells express olfactory Ca2+-activated Cl--channels and several
other olfactory “marker” proteins. It is assumed that Bestrophin proteins are likely candidates
to form functional Ca2+-activated Cl--channels. Therefore I cloned members of the Bestrophin
gene-family from ODORA cells.
I successfully isolated four full-length Bestrophin cDNAs. The cDNAs were transiently
transfected into HEK 293 cells. The proteins were detected by hemagglutinin (HA)-Tag
immunostaining. Stably transfected cell-lines were established that express each Bestrophin
isoform constitutively. Electrophysiological recordings showed that Bestrophin 1 forms Ca2+-
activated Cl--channels. Isoform-specific antibodies were raised against all four Bestrophins.
In Western Blots, Bestrophin proteins were detected by α-HA-antibodies as well as by -
Bestrophin-antibodies in membrane fractions isolated from stably transfected cell lines.
The Ca2+-activated Cl--channel in ODORA cells most likely is regulated by CaM. Therefore
Bestrophins were examined for potential CaM interaction. All Bestrophin proteins bind to
CaM-Agarose and could be eluted with Ca2+-free buffer. Amino-acid substitutions in a 1-5-8-
14 CaM binding-site of Bestrophin 2 and 3 did not change the interaction to the CaM matrix.
Immunostainings of tissue sections showed that Bestrophin 2 is expressed in olfactory
neurons, preferentially in the dendrites and the soma. In some preparations, olfactory cilia
were also stained. Because Bestrophin 2 is only moderately co-localized with cyclic
nucleotid-gated (CNGA2) channels, it is still uncertain whether Bestrophins form Ca2+-
activated Cl--channels in the olfactory epithelium.
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