Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-4174
Helbig, Annika
Biochemische und biophysikalische Untersuchungen zur Chemotaxis von Spermien des Seeigels Arbacia punctulata
158 S., 2005

Spermien orientieren sich, um für die Befruchtung zur Eizelle zu gelangen, in einem chemischen Gradienten von Faktoren, die von der Eizelle freigesetzt werden. Diesen Orientierungsprozess nennt man Chemotaxis. Für Spermien des Seeigels Arbacia punctulata ist der Faktor das Peptid Resact. Resact bindet an eine Rezeptor- Guanylylzyklase (GC), die daraufhin cGMP synthetisiert. Der Anstieg der cGMPKonzentration führt direkt oder indirekt dazu, dass Ca²⁺-Kanäle öffnen. In dieser Arbeit habe ich die GC biochemisch und funktionell charakterisiert, sowie erste Versuche zur Adaptation der Spermien durchgeführt.
Bisher wurde angenommen, dass die GC in Spermien von A. punctulata mit einer Dichte von ~ 400 GC-Molekülen/μm² im Flagellum des Spermiums vorkommt. Ich habe mit zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen eine GC-Dichte von ~ 4.700 (densitometrische Auswertung von Coomassie-gefärbten Proteingelen) bzw. ~ 11.000 GC-Molekülen/μm² (Bindestudien) nachgewiesen. Die GC-Dichte wurde also um das 12 bis 24-fache unterschätzt. Des Weiteren konnte ich durch Vernetzungsexperimente zeigen, dass die funktionelle Einheit der GC ein Trimer aus drei GC-Untereinheiten ist. Die Bindestudien zeigen, dass die Bindung von Resact an das Trimer mit negativer Kooperativität erfolgt. Dies ermöglicht der GC auf Resactkonzentrationen über einen Konzentrationsbereich von mehr als 4 Größenordnungen zu reagieren. Anhand der GC-Dichte, der Affinität für Resact und der cGMP-Bestimmung in Quenched-Flow Experimenten wurde eine Syntheserate für die aktivierte GC von 4 bis 5 cGMP/GC s^-1 bestimmt. Diese Syntheserate ist deutlich höher als bisher angenommen und entspricht in etwa der Syntheserate der GC-E aus Sehstäbchen. Die von mir bestimmte Syntheserate reicht theoretisch aus, um die Ca²⁺-Antwort des Spermiums auf die Bindung eines einzigen Resactmoleküls auszulösen.
Signalwege müssen nicht nur an- sondern auch abgeschaltet werden. Dies geschieht meist auf mehreren Ebenen des Signalweges. Ich konnte zeigen, dass die GC, als erste Komponente des Signalweges, durch Dephosphorylierung mit einer Halbwertszeit von ~ 200 ms inaktiviert wird. Erste Experimente zur Adaptation von Spermien zeigen unerwartete und interessante Ergebnisse: Auf Hintergrundkonzentrationen von etwa 0,005 bis 5 nM Resact ist das Resact-induzierte Ca²⁺-Signal (Testreiz) - im Vergleich zu Kontrolle - größer. Die Spermien reagieren also empfindlicher. Der Grad der Empfindlichkeit nimmt dabei mit der Konzentration des Testreizes zu. Erst bei sehr hohen Hintergrundkonzentrationen (> 5 nM) werden die Resact-induzierten Ca²⁺-Signale kleiner. Die Spermien desensitisieren.

In order to fertilize the egg, sperm cells orient in a chemical gradient of factors that are secreted by the egg. This process is called chemotaxis. The chemotactic factor of sperm cells of the sea urchin Arbacia punctulata is the peptide resact. Resact binds to a receptorguanylyl cyclase (GC) which synthesizes cGMP from GTP. The increase in the cGMPconcentration leads to the opening of Ca²⁺-channels - either directly or indirectly. The present study includes the biochemical and functional characterization of Arbacia-GC as well as first experiments concerning the adaptation of sperm cells.
The GC density in the flagellum of A.punctulata sperm was calculated to be ~ 400 GC molecules/μm². With two different experimental approaches, I found a 12 - 24-fold higher GC density. Densitometric analysis of Coomassie-stained protein gels and resact binding assays gave values of ~ 4.700 and ~ 11.000 GC-molecules/µm2, respectively. In Cross-link experiments I could identify the resact-receptor as a trimer formed from GC-subunits. The binding assay revealed that the receptor down-regulates its binding affinity by negative cooperativity. The receptor senses resact-concentrations varying by four orders of magnitude. By means of GC-density, resact affinity, and cGMP-measurements in quenchflow experiments I determined a rate of cGMP synthesis of 4 - 5 cGMP/GC* s^-1. The enzymatic activity of the Arbacia-GC is fairly similar to that of GC-E from vertebrate photoreceptor cells. The synthesis of 4 to 5 cGMP/GC s^-1 is sufficient to evoke a Ca²⁺-signal upon binding of a single resact-molecule.
After a signaling pathways has been activated it also has to be turned off. This can be achieved at different levels. My experiments show that the resact-receptor is inactivated by dephosphorylation with a half-life of ~ 200 ms. Pioneering experiments concerning the adaptation of sperm cells showed unexpected and interesting results: Sperm cells that have been preincubated with a background concentration of resact (0,005 to 5 nM) showed a larger Ca²⁺-signal in response to a given resact concentration (testpuls) than sperm cells that have not been preincubated with resact: So interestingly, sperm cells show an increase in sensitivity over a wide range of resact-background concentrations. Sensitization of sperm cells increases with the concentration of the testpuls. The Ca²⁺-signal becomes smaller sperm cells desensitize - when testpulses are given on a high resact-background concentration.

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