Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3675
Krafft, Bianca
Arrestin - heterologe Expression, Mutagenese und biophysikalische Untersuchungen
167 S., 1999
Arrestin ist eine entscheidende Komponente in der Abschaltung und Regulation der lichtinduzierten Signalkaskade. Nach Phosphorylierung des lichtaktivierten Rhodopsins durch die Rhodopsinkinase
(P-R*) kann Arrestin binden und eine Interaktion von P-R* mit dem G-Protein Transducin verhindern. In dieser Arbeit wurde ein heterologes Expressionssystem in S. cerevisiae für Arrestin aus Stäbchen des Rinderauges entwickelt. Rekombinantes Arrestin stimmt in seinen biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften mit dem Protein aus Retinae überein. Im SDS-Gel läuft retinales Arrestin als Doppelbande bei etwa 54 kDa, wobei N- oder C- terminale Modifikationen der rekombinanten Proteine (MRGS-6His, 6His, StrepTagII, GST) eine Verschiebung zu höheren Molekulargewichten bewirken. Nach Isoelektrischer Fokussierung zeigen die rekombinanten Arrestine größere Homogenität als das retinale Protein. Massenspektrometrische Untersuchungen und
N-terminale Proteinsequenzierung (Edmann-Abbau) ergaben, daß entsprechend dem retinalen Protein
3 bis 4 Aminosäuren des Aminoendes fehlen können. Bindungsstudien mit in vitro phosphoryliertem Rhodopsin (PMBs) beweisen lichtabhängige Bindung der rekombinanten Arrestine an P-R*. Die verschiedenen N- oder C-terminalen Modifikationen scheinen keinen Einfluß auf Bindung bzw. Spezifität zu nehmen. Die Fusionsproteine Arrestin-GST und GST-Arrestin binden ebenfalls an P-R*. Dies deutet darauf hin, daß die postulierte Konformationsänderung von einer inaktiven in eine bindende Form von Arrestin nur durch kleine Bewegung des N- oder C-Terminus erfolgen kann. Zur Lokalisierung der Interaktionsbereiche zwischen Arrestin und Rhodopsin mittels sterischer Hinderung, wurden in putative Bindungsdomänen Cysteine eingeführt, welche zur Kopplung großer Moleküle (Biotin, Fluorescein) dienen sollen. Es konnte bisher die Mutante Arrestin-V244C-6His isoliert und untersucht werden. Sie entspricht in ihrem Bindungsverhalten an PMBs dem nativen Arrestin. Die Röntgenstrukturanalyse des rekombinanten Arrestin-6His zeigt im Vergleich zum retinalen Arrestin Identität in Bezug auf Raumgruppe und Gitterkonstanten. Rekombinantes und retinales Arrestin haben eine analoge Packung im Kristall und es werden die gleichen Differenzen zwischen den Molekülen A und B der asymmetrischen Einheit festgestellt. Mit großer Sicherheit kann ausgeschlossen werden, daß verschiedene Bindungsformen (aktiv, inaktiv) von Arrestin im Kristall vorliegen. Der C-Terminus von Arrestin-6His zeigt, identisch zum retinalen Arrestin, eine hohe Flexibilität und ist in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar.
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